امروز پنجشنبه 30 شهریور 1396

همسانه‌سازی و بیان ژن آلکان هیدروکسیلاز از باکتری Pseudomonas putida

Cloning and gene expression of alkane hydroxylase gene from Pseudomonas putida

92D15

مهندسی ژنتیک

پژوهشی کامل

Fa

 

 

Pseudomonas putida یک باکتری هتروتروف بوده که قابلیت رشد روی طیف وسیعی از سوبستراها که عمده آن ها آلکان‌ها هستند، دارا می باشد. توانایی تجزیه طیف وسیعی از هیدروکربن‌ها، نشان‌دهنده برتری این ارگانیسم نسبت به اعضای دیگر جامعه میکروبی تجزیه کننده نفت می باشد. باکتری P. putida دارای سیستم آلکان هیدروکسیلاز (ژن alk-B) برای تجزیه آلکان‌ها می‌باشد. هدف از اجرای تحقیق حاضر جداسازی و بیان ژن آلکان هیدروکسیلاز باکتریP. putida می باشد. برای این منظور ابتدا همسانه‌سازی در پلاسمید pBluescript انجام شد و سپس ناحیه کدکننده ژن مذکور در پلاسمید pET-26a وارد شد. بیان ژن خارجی در سویه BL-21 از باکتری E. coli صورت پذیرفت. فعالیت آنزیم نوترکیب حاصله با تفاوت جذب اسپکتروسکپی در اثر اکسید کردن NADPH تعیین شد. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که ژن آلکان هیدروکسیلاز در پلاسمید pBluescript بهخوبی جایگزین گردید، کلنی PCR نیز این امر را تایید کرد. ژن مربوطه بهخوبی در وکتور pET-26a کلون شد. با افزایش زمان پس از القاء با IPTG ، بیان پروتئین آلکان هیدروکسیلاز افزایش یافت. پروتئین نوترکیب حاصله دارای فعالیت آنزیمی مناسب می باشد. انتقال این ژن به باکتری سریع الرشد و سوبسترای غذایی وسیع می تواند نوید بخش تولید بیوکاتالیزوری با کارایی برتر باشد.

Pseudomonas putida is a bacterium that has ability to growth on limited substrates that mainly is alkanes. The ability to use wide range of hydrocarbons is advantage of this bacterium to other bacteria community. P. putida have alkane hydroxylase system (alk-B) for alkane biodegradation. In this study alk-B gene from P. putida was amplified. Blunt cloning first done in pBluescript plasmid then sticky end cloning was carried out in pET-26 vector. For expression of this recombinant gene E. coli BL-21 bacterium were used. The activity of recombinant enzyme was done by reduction of absorbance by oxidation of NADPH. The results of this study show that alk-B gene was inserted in pBluescript plasmid. Colony PCR confirmed this insertion. This gene successfully cloned in pET-26a vector. By increasing the time after induction by IPTG expression of alk-B protein were increased. Recombinant protein has activity. Transfer of this gene to fast growth bacterium and wide substrate confirm production of robust biocatalysts in the future.

نویسندگان مقاله
ناممحل خدمتپست الکترونیکی

مهدی حسن شاهیان
Mehdi Hasanshahian

گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، انشگاه شهید باهنر کرمان، ایرانhasanshahi[AT]gmail.com نویسنده مسئول

هادی روان
Hadi Ravan

نویسنده مسئول

مقالات چاپ شده