امروز جمعه 4 اسفند 1396

مهندسی پروتئین فعال کننده پلاسمینوژن بافتی (tPA) انسانی با افزودن قطعه ژن کاسکوتین سس جهت افزایش پایداری و فعالیت آن

Protein engineering of human tissue type plasminogen activator (tPA) using active site of plant-cuscutain enzyme to increase its permanent and activity

94a174

بیوتکنولوژی گیاهی

پژوهشی کامل

Fa

 

 

پروتئین tPA یک عامل اختصاصی فیبرین است که موجب حل کردن لخته‌های خونی و جلوگیری از سکته‌ه ی قلبی و مغزی می‌گردد. کاسکوتین یک پروتئاز با فعالیت و پایداری بالا می‌باشد که در گیاهانی مثل سس وجود دارد و گیاه پارازیت از آن برای نفوذ به میزبان استفاده می‌کند. هزینه تولید پروتئین‌های نوتوکیب در گیاهان 10 الی 50 برابر کمتر از تولید همان پروتئین توسط باکتری است. اما تولید پروتئین-های نوترکیب در گیاهان هنوز با چالش‌های مهمی از جمله عملیات پایین دستی و تخلیص، پایین بودن فعالیت و پایداری پروتئین روبرو می‌باشد. پروتئین نوترکیب tPA تولید شده در گیاهان پایداری و فعالیت پایینی دارد. هدف این تحقیق، افزایش پایداری tPA با استفاده از مهندسی پروتئین و افزودن جایگاه فعال آنزیم کاسکوتین از گیاه سس به tPA و تولید پروتئین شیمری می باشد. ابتدا از گیاه سس استخراج DNA صورت گرفت و سپس با استفاده از آغازگرهای اختصاصی قطعه مورد نطر از ژن کاسکوتین تکثیر گردید. سپس به کمک تکنیک SOEing PCR قطعه کاسکوتین به ژن tPA متصل شد. قطعه tPA شیمری حاصله تحت کنترل پیشبر CaMV 35S و خاتمه دهنده NOS قرار گرفت. توالی افزایش دهنده Kozak و ترادف رمز کننده پپتید نشانه KDEL، به ترتیب به دو انتهای آمینی و کربوکسیلی ژن tPA افزوده شدند. سازه تهیه شده(pBI(tPA به روش انتقال ژن مبتنی بر اگروباکتریوم به ژنوم گیاه توتون منتقل و گیاهان تراریخت روی محیط حاوی کانامایسین انتخاب شدند. ارزیابی گیاهان تراریخت با استفاده از فنون PCR، RT-PCR، SDS-PAGE ، وسترن بلات و زیموگرافی انجام شد. نتایج نشان داد که ژن شیمریtPA به گیاهان توتون منتقل شده و در مقایسه با tPA نرمال فعالیت و پایداری آن بهبود یافته است. بنابراین مهندسی پروتئین و استفاده از بخش‌هایی از پروتئین‌های گیاهی با فعالیت و پایداری بالاتر جهت افزایش ماندگاری و فعالیت داروهای نوترکیب، می‌تواند راهکار جدیدی برای افزایش کارایی این داروها باشد.

tPA is a fibrinolitic agent that cause dissolves of blood clots and used in stroke and cardiovascular diseases. Cuscutain is a stable and highly active protease in plants such as dodder, and parasite plants using this enzyme to penetrate into host. Although produced cost of recombinant proteins in plants is 10-50 times less than bacteria, but production of recombinant proteins in plants has problems such as difficulty of downstream process, low stability and activity of purified recombinant proteins. To increase stability and activity of tPA using protein engineering, dodder-cuscutain active site was spliced to tPA. DNA was extracted from dodder plants and desired segments of cuscutain amplified using specific primers. Then, the segment of cuscutain was shuffled to tPA by SOEing PCR method. Constructed chimeric tPA was cloned under control of CaMV 35S promoter and NOS terminator. Kozak enhancer sequence and signal peptide sequence (KDEL) were added to amino and carbocyclic terminus, respectively. Construct of pBI(tPA) was transferred to tobacco plants using agrobacterium method and transgenic plants selected on kanamycin medium. Analysis of transgenic plants was performed by PCR, RT-PCR, SDS-PAGE, western blotting and zymography. Results of PCR showed that chimeric tPA was constructed using SOEing PCR. Analysis of transgenic plants using RT-PCR, SDS-PAGE and western blotting demonstrated that chimeric tPA is expressed. Moreover, zymography test showed that compared to normal tPA, produced chimeric tPA has more activity and stability. In conclusion increasing activity and stability of recombinant drugs using plant genes is promising.

نویسندگان مقاله
ناممحل خدمتپست الکترونیکی

حیدر سیفی نبی‌آباد
H Saify Nabiabad

عضو هیات علمی گیاهان دارویی دانشگاه نهاوند، نهاوند، ایران نویسنده مسئول

خسرو پیری
Kh Piri

عضو هیئت علمی گروه بیوتکنولوژی دانشگاه بوعلی سینا، همدان، ایران.kh_piri[AT]basu.ac.ir نویسنده مسئول

معصومه امینی
M Amini

فارغ ااتحصیل دکتری بیوتکنولوژی گیاهی دانشگاه بوعلی سینا، همدان، ایران نویسنده مسئول

مقالات چاپ شده